合肥雙熒光素酶報告基因實驗外包_物有所值醫藥、保養-西安淳風生物科技有限公司

雙熒光素酶報告基因實驗（luciferase Assay）目前由兩個主要的應用方向，一是檢測轉錄因子與目的基因啟動子區DNA相互作用，轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，合肥雙熒光素酶報告基因實驗外包,更優異醫藥、保養，也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異順序結合，這些特異性的序列被稱為順式因子，轉錄因子的DNA結合域和順式因子實現共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因實驗（luciferase Assay）是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段，第二是研究微小RNA(microRNA)對于靶基因的調控，通過生物信息學方法預測microRNA潛在的靶基因以及干預位點序列，并設計合適的microRNA質粒或干預片段，租合肥雙熒光素酶報告基因實驗外包,鄭州醫藥、保養，同時構建靶基因的報告基因質粒，二者同時轉染細胞，這是確定microRNA是否能影響（上調或下調）靶基因的可以選擇研究方法。 實驗原理： 1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒，如pGL3-basic（轉錄因子與靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase質粒（微小RNA與靶基因） 2） 將要檢測的轉錄因子表達質粒（或microRNA質粒）與報告基因質粒共轉染293細胞或目的細胞。如果此轉錄因子（或microRNA）能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。 3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產生熒光素，提供合肥雙熒光素酶報告基因實驗外包,貴陽醫藥、保養，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，西安淳風生物科技有限公司,西安淳風生物科技有限公司,從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。 實驗步驟（動物）： （1） 用生物信息學方法分析并預測啟動子區可能的轉錄因子結合位點。 （2） 設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒中。 （3） 篩選陽性克隆，測序，擴增克隆并提純質粒備用。 （4） 擴增轉錄因子質粒（或microRNA質粒），提純備用，同時準備相應的空載質粒對照。 （5） 培養293細胞（或其它目的細胞），并接種于6孔板中，生長24小時（80%匯合度）。 （6） 將報告基因質粒與轉錄因子表達質粒共轉染細胞。 （7） 用適當的方法提取蛋白并用于熒光素酶檢測。 （8） 加入酶作用底物，于熒光計數儀上測定熒光素酶的活性。 （9） 計算相對熒光強度，并與空載對照比較，判斷影響因子是否有效的作用于靶基因。 實驗步驟（植物）： 1. 挑取單克隆于LB液體培養。 2. 將農桿菌轉接到LB液體培養基中（加有與1相同的抗生素）。加入乙酰丁香酮和MES，28度搖床培養。 3.離心收集菌體。 4. MgCl2重懸菌體加入AS。 5. 取正處于生長期的煙草葉片，使用針頭在葉片反面扎些小孔。 6. 將侵染液裝入5 ml 注射器內，用拇指按壓注射器反板將液體從葉片下表皮注射到煙草葉片內。注射后，煙草葉片會出現濕潤的現象。 7. 注射后熒光素酶檢測試劑盒（Dual-Luciferase Assay System, Promega公司）（具體步驟詳見說明書）在promega發光檢測儀（Promega Glomax 2020）分析熒光素酶活性。 8. 根據雙報告系統測得的熒光值，算出目的基因質粒的熒光值/內參質粒熒光值（即F/R值），并算出相對于對照組的比值，求出標準誤，作出直方圖。

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